1. Общие положения
1.1 Американский гнилец (злокачественный или закрытый гнилец) — это инфекция личинок медоносных пчел и тарантулов в возрасте от 7 до 9 дней. Заболевание появляется во второй, самой жаркой части лета.
Зараженные личинки погибают, загнивают, приобретают липкую консистенцию и запах, напоминающий расплавленный древесный клей. Гниющая масса постепенно высыхает, превращаясь в толстую корку, которую трудно удалить из клеток.
Клеточные мембраны мертвых личинок становятся потемневшими, изъязвленными и поникшими (пятнистые личинки).
1.2.Возбудителем является Bac. Личинки, грамположительные, спорообразующие, подвижные, прямостоячие, округлые бациллы, расположенные поодиночке или небольшими цепочками.
1.3. диагноз американской голубой лихорадки ставится на основании эпидемических данных, характерных признаков поражения цыплят и результатов лабораторных исследований.
1.4. Образцы сотов размером 10 x 15 см, содержащие больные и мертвые личинки, отправляются в лабораторию для исследования. Образцы доставляются в фанерных или деревянных ящиках, отделенных друг от друга и от стен деревянными рейками. Соты не должны быть завернуты в бумагу.
Заплесневелый материал непригоден для тестирования.
1.5. Лабораторная диагностика американского вилта включает микроскопическое исследование мазков патологического материала и последующее выделение культур патогена для идентификации.
2. Микроскопическое исследование
2.1 Мазки готовятся из разложившихся личинок или высушенных комочков кожи. Для этого из ячейки сота пинцетом извлекают не менее 10 мертвых личинок или наружных шкурок и помещают в пробирку, содержащую 5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое пробирки кипятят в пламени спирта, охлаждают и соскабливают до получения однородной суспензии.
2.2. Нанесите одну каплю приготовленной суспензии на поверхность предметного стекла и распределите тонким слоем. Высушите мазок на воздухе, зафиксируйте на пламени и окрасьте красителем Грама и 2% спиртовым раствором карбоната фуксина в течение 1,5-2 мин для выявления спор.
Если возбудитель присутствует, на мазке обнаруживаются овальные споры и одна грамположительная палочка.
3. Бактериологическое исследование
3.1 Изолируйте культуры Vas. Инокулируйте суспензию личинок, приготовленную, как описано в разделе 2.1, в МПА, дополненную PBS и 10% нормальной лошадиной сывороткой или средой Уайта (см. Приложение 1).
Культуры инкубируются в инкубаторе при температуре 37-38 °C в течение 24-72 часов.
3.2 После 24 часов инкубации в жидкой культуральной среде личинки Вас. становятся мутными, а через 48-72 часа среда становится прозрачной. Личинки Vas. становятся мутными, и на дне пробирки образуется осадок.
Через 48-72 часа инкубации появляются твердые, изогнутые, слегка выпуклые колонии, сначала прозрачные, а затем на серовато-белом твердом субстрате. Впоследствии наблюдается твердый рост в виде серовато-белого осадка на поверхности агара.
3.3 Изолированные культуры идентифицируются на основе морфологических, культуральных и биохимических характеристик.
Возбудитель американского пчелиного гнильца расщепляет глюкозу с образованием безгазовой кислоты, не сбраживает мальтозу, сахарозу или арабинозу, восстанавливает нитраты до нитритов, не образует каталазу и не обладает гемолитической активностью (см. Приложение 2).
3.3.1.Ферментативные свойства выделенных культур изучают, инкубируя их в течение 2-5 дней в жидкой среде, дополненной 10% нормальной лошадиной сывороткой.
3.3.2 Преобразование нитрата в нитрит. Изолированные культуры инокулируют в PBS, содержащий сыворотку и 1% нитрата калия. После 48-72 часов инкубации при 37-38°C в пробирку добавляют 0,5 мл 0,5% раствора крахмала и равный объем 0,5% раствора йодида калия. Хорошо перемешайте содержимое пробирки, добавьте одну каплю 5%-ного раствора серной кислоты и встряхните. В присутствии нитрита калия цвет среды становится темно-синим.
3.3.3 Для измерения активности каталазы одну каплю 3%-ного раствора перекиси водорода помещают на предметное стекло и не выделяют газ в дневных агаровых культурах патогенных петель.
3.3.4. Гемолитическую активность возбудителя измеряют на глюкозо-перфузионном агаре (см. Приложение 1).
Через 24-48 часов в агаре на чашках Петри появляется серовато-белый налет с дисковидными краями без гемолитических зон.
4. диагноз американской филлоксеры считается установленным, если обнаружена культура с характерными признаками Vas. Личинки.
5. срок расследования — до 10 дней.
Главное ветеринарное управление Государственного комитета аграрной промышленности СССР.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Методические указания по лабораторной диагностике болезни Роттерреля у американских медоносных пчел.
1. белая середина. Протрите скорлупу свежих куриных яиц ватой, смоченной спиртом, сожгите, асептически откройте, отделите яичные белки и вылейте желтки в колбу, содержащую 70 мл стерильной водопроводной воды. Встряхните содержимое колбы для хорошего перемешивания, перелейте в пробирку объемом 10 мл и охладите. При необходимости асептически добавьте 10 мл эмульсии яичного желтка к 50 мл раствора для лизиса и охладите до 45-50 ° MVA. Хорошо перемешайте агар и яичный желток круговыми движениями и вылейте в чашку Петри.
Храните затвердевшую среду в термостате в течение 24 часов для проверки стерильности.
2. кровяной агар с глюкозой. Перелейте SMI (pH 7,2 — 7,4) в колбы объемом 100 мл и автоклавируйте при 1 атм в течение 30 мин.
При необходимости растворите агар на кипящей водяной бане, охладите до 45-50 °C, добавьте 2% декстрозы и 15-20 мл свежей стерильной лигированной крови лошади (ягненка, коровы) и осторожно перемешайте, не вспенивая смесь. Перелейте среду в блюдо и выдержите в инкубаторе в течение 4-6 часов для застывания, затем дайте высохнуть.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Методические указания по лабораторной диагностике гриппа и пчелиного гриппа в США и Европе
